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突破性发现：AAV相关肝炎患者肝内检出断裂基因组！
撰文：安一
基因治疗曾被视为罕见病的救命稻草，尤其是腺相关病毒（AAV）载体，凭借其安全性和高效性，已成功用于脊髓性肌萎缩症（SMA）、血友病等多种疾病的治疗。截至2025年，美国FDA已批准7款AAV基因疗法，更多疗法仍在临床试验中。
但光鲜背后，肝毒性始终是悬在AAV基因治疗头上的“达摩克利斯之剑”——静脉输注后，肝细胞损伤极为常见，部分患者甚至出现暴发性肝衰竭，不得不依赖大剂量激素治疗。尽管这一问题已困扰临床多年，但其背后的深层机制却一直模糊不清。
近日，发表在《Nature Medicine》上的一项病例研究[1]，通过先进的宏基因组测序技术，首次在肝损伤患者的肝脏组织中发现了制造工艺残留的质粒序列、断裂重组的载体基因组，以及潜在的辅助病毒感染，为破解AAV相关肝毒性的谜题提供了关键线索。
病例聚焦：7岁脊髓性肌萎缩女孩的治疗困境
研究团队聚焦于一名7岁女性脊髓性肌萎缩1型（SMA 1）型患者，该患者携带SMN1基因7号外显子纯合缺失，仅保留2个SMN2拷贝。由于体重超过20kg，她接受了高剂量的onasemnogene abeparvovec（OA，一款获批用于SMA治疗的AAV9载体基因疗法），总剂量达2.2×10¹⁵载体基因组（vg）。
治疗后不久，患者就出现了明显的肝炎症状：呕吐、黄疸、腹痛伴尿色加深。实验室检查显示，血清肝损伤标志物在输注后7周达到峰值，其中丙氨酸转氨酶（ALT）升至1236 U/L，γ-谷氨酰转移酶（GGT）362 U/L，总胆红素137 μmol/L，提示严重的肝细胞损伤和胆汁淤积。
临床团队随即采用激素联合他克莫司进行治疗，他克莫司在7个月后成功停药，但激素治疗持续了19个月才逐步减量。为明确肝损伤的根本原因，医生在患者肝损伤峰值时进行了肝穿刺活检，并开展了全面的基因组学分析。
测序揭秘：肝脏中藏着“制造残留”质粒
研究团队对患者肝脏组织样本进行了短读长和长读长宏基因组测序，同时结合原位杂交技术，意外发现了三类本不该出现在患者体内的不速之客——OA制造过程中使用的三种质粒序列。
OA的生产需要依赖三种关键质粒（图1）：pSMN（携带治疗性SMN基因）、pAAV2/9（提供AAV2复制基因rep和AAV9衣壳基因cap）、pHelper（提供腺病毒辅助复制基因）。理论上，经过严格的生产纯化，最终输注给患者的应只有包裹着SMN基因的AAV9病毒颗粒，质粒片段应被完全去除。
但测序结果显示，患者肝脏中不仅存在完整的OA载体基因组，还检测到了pSMN的质粒骨架、pAAV2/9的全长序列，以及部分pHelper片段。原位杂交验证进一步证实，5.1%的肝细胞中存在三种质粒共有的细菌复制起点序列，5.8%的肝细胞中检测到pAAV2/9特有的AAV9衣壳基因序列，而SMN基因的阳性细胞比例达28.5%（对照组仅0.4%-1.5%），明确了这些质粒序列并非测序污染，而是真实存在患者肝脏中。
图1 制备OA所用质粒的示意图及其作用机制
更值得关注的是，这些质粒序列并非完整存在，而是以片段形式与载体基因组相互融合，形成了复杂的重组产物。研究人员推测，这些质粒残留可能是生产过程中“反向包装”或纯化不彻底导致的，而它们在体内与载体基因组的重组，可能触发了异常的免疫反应或直接损伤肝细胞。
基因组乱象：断裂、串联与跨界融合
除了质粒污染，测序还揭示了载体基因组在患者肝脏中的混乱状态。正常情况下，AAV载体进入肝细胞后，会以单链DNA形式释放，随后形成双链DNA，并组装成环状游离体进行基因表达。但该患者的载体基因组却出现了三大异常（图2）：
1
广泛断裂与串联化
载体基因组发生了大量断裂，同时通过“头对头”“头对尾”等方式串联形成多聚体，这种结构与AAV复制过程中的滚环扩增特征相似。部分串联后的DNA长度超过15 kb，远超AAV载体5 kb的最大包装容量，说明这些结构不可能是生产过程中包装进去的，而是在患者体内形成的。
2
质粒-载体-人类基因组重组
长读长测序发现，许多重组片段同时包含质粒序列（如pAAV2/9的rep/cap基因、pHelper的腺病毒基因）、载体基因组和人类基因组序列，形成了复杂的“三方融合体”。短读长测序进一步证实，载体基因组与人类基因组之间存在大量融合连接点，分布在多个基因内部，但未发现明显的整合热点区域。
3
内部重排与异常转录
载体基因组自身也发生了频繁的内部重排，主要集中在反向末端重复序列（ITR）区域，同时检测到非经典剪接融合产物。不过幸运的是，这些异常重排的DNA大多没有产生稳定的转录本，未形成大量异常蛋白。
图2 肝活检结果
a. 患者肝活检可见显著的门周炎症、小叶炎症及界面性炎症，同时存在大量伴气球样变性的肝细胞。
b. 图a 框选区域的高倍镜视野，可见气球样变肝细胞的胞质呈明显肿胀表现。
c. 图 a 中标记区域的放大视野。
d. 图 a 中标记区域的放大视野
e~g. 采用免疫组织化学（IHC）染色检测 CD20（e）、CD8（f）及 CD4（g）的表达，显示肝脏组织内的炎症浸润情况。
h. 腺病毒免疫染色结果为阴性。
研究人员分析，这些复杂结构的形成可能与质粒残留中的rep基因、腺病毒辅助基因表达有关——这些基因可能激活了载体基因组的异常复制，进而导致断裂、串联和重组；也可能是ITR序列驱动的分子间重组所致。
意外发现：HHV-6B感染的潜在角色
在基因组分析中，研究团队还意外检测到了人类β疱疹病毒6B（HHV-6B）的完整基因组，PCR验证显示其循环阈值（CT）为26.2，提示患者存在HHV-6B感染，但未检测到该病毒的RNA转录本，说明此时病毒处于潜伏状态。
HHV-6B之所以值得关注，是因为它可能作为“辅助病毒”促进AAV的复制。此前研究发现，HHV-6家族病毒能提供AAV复制所需的关键因子，而在野生型AAV2相关的儿童肝炎患者肝脏中，也常能检测到HHV-6感染。
不过，由于这是单病例研究，目前尚无法确定HHV-6B感染是肝损伤的直接原因，还是通过促进AAV载体异常复制间接加重损伤，这一关联仍需更多病例验证。
临床启示：基因治疗的安全边界在哪？
这项研究虽然仅聚焦于一名患者，但揭示的现象为理解AAV相关肝毒性提供了全新视角，也给临床实践和疗法开发带来了重要启示：
1
肝毒性机制可能是“多重打击”
以往认为，AAV肝毒性主要与衣壳蛋白引发的免疫反应有关，但本研究提示，制造残留的质粒序列、异常重组的载体基因组、潜在的辅助病毒感染可能共同构成“多重打击”，触发肝细胞损伤或免疫激活。尤其是质粒中的细菌序列（如复制起点、抗生素抗性基因），可能通过TLR9通路激活先天免疫，这与此前发现的“载体外DNA引发免疫反应”的结论一致。
2
生产工艺需要更严格的质控
目前，即使遵循良好生产规范（GMP），AAV制剂中仍可能残留少量质粒片段、空衣壳等杂质。研究结果提示，这些“微量杂质”可能具有显著的生物学效应，未来需要优化纯化工艺，进一步降低质粒残留和异常重组产物的含量，同时加强对制剂中杂质的检测和定量。
3
临床监测需关注“基因组异常”
对于接受高剂量AAV基因治疗的患者，尤其是体重较大的年长患者（本研究患者肝毒性更严重，与此前观察到的“高剂量、高体重患者风险更高”一致），除了常规监测肝酶，未来可能需要开发无创检测方法，监测体内质粒残留和载体基因组重组情况，提前预警肝损伤风险。
4
仍需更多研究验证因果关系
需要强调的是，这是一项单病例研究，仍有诸多问题待解答：质粒残留和异常基因组结构在无肝损伤的AAV治疗患者中是否存在？HHV-6B感染与肝损伤的关联是否具有普遍性？这些异常结构是导致肝损伤的直接原因，还是损伤后的结果？
未来，需要开展更大规模的队列研究，对比肝损伤与无肝损伤患者的肝脏组织样本，明确这些异常现象与肝毒性的因果关系，同时探索如何通过优化载体设计、生产工艺和联合用药，降低肝损伤风险。
参考文献：
[1]Buddle S, Brown LK, Morfopoulou S, et al. Contaminating plasmid sequences and disrupted vector genomes in the liver following adeno-associated virus gene therapy. Nat Med. 2026 Jan 16.
责任编辑：叶子
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